생세포수의 계산

동물 세포의 생사 판단은 색소법, 즉 세포의 색소 환원능력(MTT assay), 색소배제 능력(Trypan Blue 법)
또는 색소를 받아들이는 능력의 유무(Neutral Red법)를 기준으로 하는 경우가 많다.
이중에서 가장 많이 사용되는 방법은 trypan blue 법이다.

Trypan Blue 법
Trypan blue 입자는 세포막을 확산의 방법으로 통과하여 세포 내부로 유입되는데 생세포는
ATP 에너지를 이용한 exocytosis로 trypan blue 입자를 다시 세포 외부로 배제하게 되나, 에너지를
발생할 수 없는 사세포는 exocytosis를 할 수 없어 청색으로 염색된다. 세포를 혈청이 없는 배지로 희석하여
대략 200 - 2,000 cells/ml 되도록 한다. 1 ml의 현탁된 세포와 4 ml의 0.4% trypan blue 용액을 혼합하여 5분간
정치한 후 hemocytometer를 사용하여 염색되지 않은 생세포수와 염색된 사세포의 수를 측정하여 생존율을 계산한다.

생존율을 측정할 때 주의해야 할 것은 세포를 trypan blue에서 염색하는 시간을 일정하게 해야 한다.
염색시간이 지나치게 길면 본래 염색되지 않는 생세포까지 청색으로 염색되고, 지나치게 짧으면
본래 염색되어야 할 사세포가 염색되지 않는 결과가 나타난다. 또한 측정할 세포의 수가 너무 적거나
너무 많으면 측정 오차가 크게 된다.
따라서 세포를 적당히 희석하여 대략 200-2,000 cells/ml되게 한 후 측정해야 한다.

MTT Assay
측정해야 할 세포의 수가 너무 적으면 trypan blue 법을 사용할 수 없게 되는데 이때 MTT assay를 이용한다.
MTT 는 담황색의 물질로서, 생세포의 mitochondria 내의 호흡쇄효소에 의해 암청색의 formazan으로 전환된다.
그러나 사세포에서는 이러한 반응이 일어나지 않는다.
생성된 formazan을 0.04 N HCl-isopropanol 용액으로 추출하여 570 nm의 흡광도에서 정량한다.
Formazan의 생성량은 생세포수에 비례하므로 생세포수 측정에 이용한다.

Neutral Red 법
Neutral red (3-amino-7-dimethyl amino-2-methyl-phenazine HCl)는 생세포내에서 lysosome에 축적된다.
Neutral red 축적량은 생세포수에 비례하므로 생세포수의 고감도 측정법으로 이용하게 된다.