Serum-Free CHO media 또는 protein-free CHO media로의 적응 방법

Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 CHO 세포에 사용하기 위해서는 적응 기간이 필요하다. 적응 방법은 direct adaptation I, direct adaptation II, sequential adaptation의 3 방법이 있다.

 

Direct Adaptation I 

– 부착 배양의 경우 (부착 배양 → 부착 배양)

1. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 37°C 수조에서 항온한다.
2. 혈청 배지에서 배양된 CHO 세포가 80% 이상의 confluence에 도달하면, 배양액을 제거하고 trypsin 또는 trypsin-EDTA 용액을 세포가 부착되어 있는 배양용기 표면에 골고루 묻힌 후 제거한다.
3. 37°C 배양기에서 2 – 3 분 동안 반응시키고 세포를 배양 용기 표면에서 떼어내어 혈청배지 또는 trypsin inhibitor로 중화시킨 후 800 rpm에서 5 분간 원심한다.
4. 상층액을 버리고 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media로 세포를 현탁한 후 800 rpm에서 5분간 다시 원심한다.
5. 상층액을 버리고 4 x 10⁴ cells/cm² (2 x 10⁵ cells/ml)의 접종 농도로 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에 배양한다.

 

– 부유 배양의 경우 (부착 배양 → 부유 배양)

1. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 37°C 수조에서 항온한다.
2. 혈청 배지에서 배양된 CHO 세포가 80% 이상의 confluence에 도달하면, 배양액을 제거하고 trypsin 또는 trypsin-EDTA 용액을 세포가 부착되어 있는 배양용기 표면에 골고루 묻힌 후 제거한다.
3. 37°C 배양기에서 2 – 3 분 동안 반응시키고 세포를 배양 용기 표면에서 떼어내어 혈청 배지 또는 trypsin inhibitor로 중화시킨 후 800 rpm에서 5 분간 원심한다.
4. 상층액을 버리고 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media로 세포를 현탁한 후 800 rpm에서 5 분간 다시 원심한다.
5. 상층액을 버리고 2 - 5 x 10⁵ cells/ml의 접종농도로 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에 현탁한다. 세포 현탁액을 spinner flask로 옮겨 40 - 100 rpm의 교반속도로 배양한다. 초기 세포 농도를 처음에는 높이다가 점차 낮추어 주는 것이 바람직하다.

 

Direct Adaptation II 

– 부착 배양의 경우 (부착 배양 → 부착 배양)

1. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 37°C 수조에서 항온한다.
2. 혈청 배지에서 부착 배양된 CHO 세포가 90% 이상의 confluence에 도달하면, 혈청 배지를 제거하고 serumSerum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media로 교환한다.
3. 매일 또는 2 일에 1 - 2회씩 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media로 교환하면서 용기 바닥으로부터 떨어지는 세포는 버리고 원래의 세포 모양을 유지하며 부착되어 있는 세포를 계속 배양한다.
4. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에서 세포 성장이 확인된 세포를 취하여 계대 배양하고 세포 성장을 재확인한다. 계대 배양시 4 x 10⁴ cells/cm² (2 x 10⁵ cells/ml)의 접종 농도에서 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에 배양한다.

 

– 부유 배양의 경우 (부착 배양 → 부유 배양)

1. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 37°C 수조에서 항온한다.
2. 혈청배지에서 부착 배양된 CHO 세포가 90% 이상의 confluence에 도달하면, 혈청배지를 제거하고 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media로 교환한다.
3. 매일 또는 2일에 1 - 2회씩 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media로 교환하면서 부유되는 세포를 하나의 T-flask에 모아 계속 배양한다.
4. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에서 세포 증식이 확인된 flask를 취하여 계대 배양하고, 세포 증식을 재확인하다. 세포 증식이 재확인된 flask의 세포는 2 - 5 x 10⁵ cells/ml의 접종 농도로 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에 현탁하여 spinner flask로 옮기고 40 - 100 rpm의 교반 속도로 배양한다. 초기 세포 농도를 처음에는 높이다가 점차 낮추어 주는 것이 바람직하다.

 

Sequential Adaptation 

– 부착 배양의 경우 (부착 배양 → 부착 배양)

1. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 37°C 수조에서 항온한다.
2. 혈청배지에서 부착배양된 CHO 세포가 80% 이상의 confluence에 도달하면, 세포를 trypsin이나 trypsin-EDTA 용액을 이용하여 떼어낸 후 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 75% : 25%로 하여 4 x 10⁴ cells/cm² (2 x 10⁵ cells/ml)의 접종 농도에서 배양한다.
3. 같은 조건에서 계대 배양을 2 - 4번 반복하여 세포 증식을 확인 (기존배양과 비교하여 90% 이상의 세포성장을 보여야 함) 하고 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 50% : 50%로 하여 4 x 10⁴ cells/cm² (2 x 10⁵ cells/ml)의 접종 농도에서 배양한다.
4. 의 과정을 반복하되 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 25% : 75%로 한다.
5. 의 과정을 반복하되 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 10% : 90%로 한다. 혈청배지의 비율이 낮아지면 trypsin 처리후 trypsin-inhibitor를 처리한다.
6. 의 과정을 반복하되 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 5% : 95%로 한다. 혈청배지의 비율이 낮아지면 trypsin 처리후 trypsin-inhibitor를 처리한다.
7. 의 과정을 반복하되 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media만으로 배양한다. 단 5.번과 6.번은 생략할 수 있다. 혈청배지의 비율이 낮아지면 trypsin 처리후 trypsin-inhibitor를 처리한다.
8. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에서 세포 증식이 확인되면 세포를 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media가 포함된 동결 배지에 동결보존하고 다시 한번 용해하여 세포 활력을 검사한다.

 

– 부유 배양의 경우 (부착 배양 → 부유 배양)

1. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media를 37°C 수조에서 항온한다.
2. 혈청배지에서 부착배양된 CHO 세포가 80% 이상의 confluence에 도달하면, 세포를 trypsin이나 trypsin-EDTA 용액을 이용하여 떼어낸 후 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 75% : 25%로 하여 3 - 5 x 10⁵ cells/ml의 접종 농도에서 배양한다.
3. 같은 조건에서 계대 배양을 2 - 4번 반복하여 세포 증식을 확인 (기존배양과 비교하여 90% 이상의 세포성장을 보여야 함) 하고 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 50% : 50%로 하여 3 - 5 x 10⁵ cells/ml의 접종 농도에서 배양한다.
4. 의 과정을 반복하되 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 25% : 75%로 한다.
5. 의 과정을 반복하되 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 10% : 90%로 한다.
6. 의 과정을 반복하되 혈청배지와 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media의 비율을 5% : 95%로 한다.
7. 의 과정을 반복하되 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media만으로 배양한다. 단 5.번과 6.번은 생략할 수 있다.
8. Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media에서 세포 증식이 확인되면 세포를 Serum-Free CHO Media 또는 Protein-Free CHO Media가 포함된 동결 배지에 동결보존하고 다시 한번 용해하여 세포 활력을 검사한다.