Transformation of E. coli (CaCl2 and heat-shock method)
Competent Cell의 준비
1. 1 ml의 LB broth (MM 001-01 또는 MM 002-01) 나 2X YT broth (MM 008-01)에 한 개의 E. coli colony를 접종하고
37°C에서 overnight 진탕 배양한다 (200 rpm).
2. 1 ml의 배양액을 100 ml의 동일한 새로운 배지에 접종하고 37°C에서 진탕 배양한다.
- 수시로 흡광도를 측정하여 A600 = 0.45 ~ 0.55일 때 까지 배양한다.
3. 원심분리(4,000 X g, 4°C, 10 분)한 후 상등액은 버린다.
4. 세포 침전물을 10 ml의 ice-cold 0.1 M CaCl2 용액으로 현탁시킨다.
5. 3.-4.과정을 한 번 더 반복한다.
6. 4°C에서 18 시간 동안 방치한다.
7. 200 μl 씩 분주하여 -80°C에 보관한다.
형질전환 (Transformation)
1. -80°C에 보관되어 있는 200 μl의 competent cell을 꺼내어 0°C (on ice)로 녹이고 10 μl의 DNA 용액을 첨가한다.
2. 잘 섞은 후 0°C (on ice)에서 30 분 동안 방치한다.
3. 42°C 수조에 옮겨 90 초 동안 방치한다.
4. 0°C (on ice)로 옮겨 90 초 동안 방치한다.
5. 37°C로 미리 항온시킨 800 μl의 LB broth 또는 SOC broth (MM 006-01)를 첨가한다.
6. 37°C에서 45 분 동안 진탕 배양한다.
7. 적절한 selection agent (e.g. 50 μg/ml ampicillin)가 포함된 LB agar plate 또는 SOB agar plate에 200 μl 씩의
배양액을 도말한다.
8. 37°C 배양기에서 overnight 배양한다.
- 형질전환 균주(transformants)는 12~16 시간 후면 나타나기 시작한다.
- Selection agent로 항생제(e.g. ampicillin)를 사용했을 경우 20 시간 이상 배양하게 되면 형질전환 균주 주변에
satellite colony 들이 나타나게 되는데 이것은 형질전환 균주가 selection agent를 분해하는 효소를 분비하기 때문이다.
1. 1 ml의 LB broth (MM 001-01 또는 MM 002-01) 나 2X YT broth (MM 008-01)에 한 개의 E. coli colony를 접종하고
37°C에서 overnight 진탕 배양한다 (200 rpm).
2. 1 ml의 배양액을 100 ml의 동일한 새로운 배지에 접종하고 37°C에서 진탕 배양한다.
- 수시로 흡광도를 측정하여 A600 = 0.45 ~ 0.55일 때 까지 배양한다.
3. 원심분리(4,000 X g, 4°C, 10 분)한 후 상등액은 버린다.
4. 세포 침전물을 10 ml의 ice-cold 0.1 M CaCl2 용액으로 현탁시킨다.
5. 3.-4.과정을 한 번 더 반복한다.
6. 4°C에서 18 시간 동안 방치한다.
7. 200 μl 씩 분주하여 -80°C에 보관한다.
형질전환 (Transformation)
1. -80°C에 보관되어 있는 200 μl의 competent cell을 꺼내어 0°C (on ice)로 녹이고 10 μl의 DNA 용액을 첨가한다.
2. 잘 섞은 후 0°C (on ice)에서 30 분 동안 방치한다.
3. 42°C 수조에 옮겨 90 초 동안 방치한다.
4. 0°C (on ice)로 옮겨 90 초 동안 방치한다.
5. 37°C로 미리 항온시킨 800 μl의 LB broth 또는 SOC broth (MM 006-01)를 첨가한다.
6. 37°C에서 45 분 동안 진탕 배양한다.
7. 적절한 selection agent (e.g. 50 μg/ml ampicillin)가 포함된 LB agar plate 또는 SOB agar plate에 200 μl 씩의
배양액을 도말한다.
8. 37°C 배양기에서 overnight 배양한다.
- 형질전환 균주(transformants)는 12~16 시간 후면 나타나기 시작한다.
- Selection agent로 항생제(e.g. ampicillin)를 사용했을 경우 20 시간 이상 배양하게 되면 형질전환 균주 주변에
satellite colony 들이 나타나게 되는데 이것은 형질전환 균주가 selection agent를 분해하는 효소를 분비하기 때문이다.